İMMUNAT Ürünleri ile Yapılan Araştırma

TİCARİ OLARAK SATILAN CURCUMA LONGA, EQUISETUM ARVENSE,
OLEA EUROPAEA YAPRAĞI VE PLANTAGO LANCEOLOTA EKSTRAKTLARININ İN-VİTRO ANTİBAKTERİYEL AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI

Şinasi AŞKAR, Sümeyra SEVİM


Giriş: Patojen mikroorganizmalara karşı kullanılan antibakteriyel maddelere direncin artması ve gıda katkı maddelerinin istenmeyen yan etkileri yeni bitki kaynaklı antibakteriyel maddeleri aramayı gerekli kılmıştır.

Amaç: Bu çalışmada, ticari olarak satılan Curcuma longa, Equisetum arvense, Olea europaea yaprağı ve Plantago lanceolota ekstraktlarının bazı gram negatif ve gram pozitif bakterilere karşı antibakteriyel aktivitelerinin in-vitro olarak araştırılması amaçlanmıştır.

Yöntem: Dört farklı bitkiden etanol ekstraksiyonu ile elde edilen ekstraktların disk difüzyon yöntemiyle, Escherichia coli (ATCC 259222), Genişleşmiş Spektrumlu Beta Laktamaz (ESBL) Escherichia coli (ATCC 35218) ve Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterococcus faecalis (ATCC 291212), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Metisilin Dirençli S.aureus (MRSA) (Klinik izolat)  üzerine antibakteriyel aktiviteleri araştırıldı.

Bulgular: Çalışma sonuçlarına göre, en yüksek antibakteriyel aktivite Olea europaea yaprağı ekstraktından elde edildi. Olea europaea yaprağı ve Plantago lanceolota ekstraktlarının P. aeruginosa, MRSA ve S.aureus’a karşı, Equisetum arvense ekstraktı MRSA ve S.aureus’a karşı antibakteriyel aktivite gösterdi. Ayrıca, Curcuma longa ekstraktının P. aeruginosa ve S.aureus’a karşı antibakteriyel aktivitesinin olduğu belirlendi.

Sonuç: Başta Olea europaea yaprağı ekstraktı olmak üzere, diğer bitki ekstraktlarının medikal ve gıda endüstrisi gibi birçok alanda bakterilere karşı etkili olabileceği düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler: Antibakteriyel aktivite, Ticari bitki ekstraktları

In-vitro Antimicrobial Activities of Commercial Curcuma longa, Equisetum arvense, Olea europaea Leaf and Plantago lanceolota Extracts

ABSTRACT

Introduction: The increased resistance to antimicrobial agents that used against to pathogen microorganisms, and unwanted side effects of food additives have necessitated a search for new antimicrobial substances from plants.

Objective: In this study, in-vitro antibacterial activities of commercial Curcuma longa, Equisetum arvense, Olea europaea Leaf and Plantago lanceolota extracts on some Gram-negative and Gram-positive bacteria were investigated.

Method: We were investigated antibacterial activities of four different plant extracts, obtained by ethanol extraction, on Escherichia coli (ATCC 259222), Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL) Escherichia coli (ATCC 35218), Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterococcus faecalis (ATCC 291212), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Methicillin Resistant S.aureus (MRSA) (isolate of clinic)   by disk diffusion method.

Results: Olea europaea leaf extract showed the highest antibacterial activity. However Olea europaea leaf and Plantago lanceolota extracts showed antibacterial activities against to P. aeruginosa, MRSA and S.aureus, Equisetum arvense extract showed antibacterial activities against to MRSA and S.aureus. And also we determined that Curcuma longa extract have antibacterial activities against to P. aeruginosa and S.aureus.

Conclusion: Particularly Olea europaea leaf extract, besides other plant extracts are thought to be effective against to bacteria in many areas like medical and food industries.

Key Words: Antimicrobial Activity, Commercial Plant Extract

GİRİŞ

Bitkilerde şifa gücü arama insanlık tarihi kadar eskidir. Tarih boyunca tüm kıtalarda insanlar uzun süre yüzlerce yerli bitkiyi yara lapası veya içerek uygulamışlardır. Bugünkü Irak’ta, 60.000 yıl önce yaşayan ilkel insanların Alcea rosea (Gülhatmi) gibi bitkileri kullandığına dair kanıtlar vardır. Bitkiler hala dünyada yaygın olarak geleneksel (etnik) tedavi amacıyla kullanılmaktadır. Şu anda, tedavi amaçlı kullanılan ilaçların büyük çoğunluğu bitki kökenli olmasına rağmen, çok azı antimikrobiyal madde olarak kullanılmaktadır. Antimikrobiyal madde olarak daha çok bakteri ve mantar kaynaklarından faydalanılmaktadır.

Son yıllarda bitki özlerinin antimikrobiyal etkilerinin araştırılmasına ilginin artmasının çeşitli nedenleri vardır. İnsanlığın mevcut antimikrobiyal ilaçlara karşı gelişen direncin farkına varması, fitokimyasalların antimikrobiyal ilaçlar için bir çeşit cephanelik olması, bitki bazlı terapötik ajanların doğal özellikte olmaları, narkotik özellik taşımamaları, daha az yan etkiye sahip olmaları, ucuz olmaları, sinerjik etki gösterebilmeleri ve kolayca biyo-bozunur özellikte olmaları bu nedenler arasında sayılabilir.

Bitkiler aromatik maddeler sentezleme konusunda neredeyse sınırsız bir yeteneği sahiptirler. Bu maddelerin çoğu fenol türevlerdir. Fitokimyasallar koku, pigment, lezzet ve antibakteriyel vb. özellikte maddeler olarak görev almaktadır. Bitkilerde bilinen başlıca antimikrobiyal maddeler tablo 1’de verilmiştir.

Tablo 1. Bitkilerin antimikrobiyal içeriğinin majör sınıflandırılması

SınıfAlt sınıfÖrnekMekanizma
Fenolikler

 

 

 

 

 

 

Basit fenollerKatekolSubsrat deprivasyonu
EpikateşinMembran bozulması
Fenolik asitlerSinamik asitBelirtilmemiş
KuinonlarHiperisinAdezin için bağlama, hücre duvarıyla kompleks yapma, enzimleri inaktive etme
FlavanoidlerKrisinAdezin için bağlama
Flavonlar BelirtilmemişHücre duvarıyla kompleks yapma
AbyssinoneEnzimleri inaktive etme
HIV ters transkripsiyon-enziminin inhibisyonu
FlavanolTotarolBelirtilmemiş
TaninlerEllagitaninProtein için bağlama
Adezin için bağlama
Enzim inhibisyonu
Subsrat deprivasyonu
Hücre duvarıyla kompleks yapma
Membran bozulması
Metal iyon kompleksi oluşturma
KumarinlerVarfarinÖkaryoyik DNA ile etkileşim (antiviral aktivite)
Terpanoidler, esansiyel yağlarKapseinMembran bozulması
AlkaloidlerBerberin, PiperinHücre duvarı ve / veya DNA içine ekleme yapmak
Lektinler ve polipeptitlerMannoz- Spesifik agglutininViral yüzey tutumunu veya birlşmesini bloke etmek
FabatinDisülfit bağlarının formları
Poliasetilenler8S-Heptadeka- 2(Z), 9(Z)- diene – 4,6- diyne- 1,8- diolBelirtilmemiş

 

Olea europaea (zeytin ağacı) yaprağı ekstraktı, zeytin ağacı yapraklarından elde edilen koyu kahverengi, acı tatlı bir maddedir. Akdeniz ülkelerinde binlerce yıldır  zeytin ağacı yaprağı  yaygın bir biçimde geleneksel tıp tedavilerinde kullanılmaktadır. Geçmişte sıtma tedavisinde ve ateşli hastalıklarda kullanılmıştır. Zeytin yaprağının içeriğinde hydroxytyrosol, tyrosol, caffeic acid, p-coumaric acid, vanillic acid, vanillin, oleuropein, luteolin, diosmetin, rutin, verbascoside, luteolin-7-glucoside, apigenin-7-glucoside ve diosmetin-7-glucoside maddeleri bulunur. Bu fenolik bileşikler içerisinde en çok oleuropein maddesi vardır. Zeytin yaprağından ekstre edilen fenolik bileşiklerin çeşitli bakterilere Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus  antibakteriyel etkinlikleri bildirilmiştir. Ayrıca zeytin yaprağı fenolik bileşiklerinin diğer fenolik bileşenlerle sinerjik etkileri bildirilmiştir. Zeytin yaprağı ve zeytin yaprağı ekstresi için gıda alanında son zamanlarda koruyucu madde olarak talebin arttığı bildirilmiştir.

Curcuma longa (Zencefil) Pakistan, Hindistan, Çin ve Bangladeş başta olmak üzere Asya’nın tropik bölgelerinde yetişen sarıçiçekli, büyük yapraklı, rizomlu çok yıllık bir bitkidir. En önemli etken maddesi Curcumin (1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione)’dir. Curcumin, Curcuma longa bitkisinin rizomlarından elde edilen doğal bir polifenolik flavonoid’dir. Curcumin baharat ve gıda boyası (gıda katkı maddesi numarası E100) olarak ayrıca akut ve kronik hastalıkların (iltihaplı bağırsak hastalıkları, diyabet ve astım)  tedavisinde kullanılmaktadır. Helicobacter, Vibrio vulnificus, Pseudomonas aeruginosa gibi çeşitli bakterilere karşı antibakteriyel aktivitesi olduğu bildirilmiştir.

Plantago cinsi (Sinirli ot, Damar otu), Plantaginaceae familyası içerinde bulunan en önemli cinslerden biridir. Çok yıllık bitkilerdir ve dünyanın her bölgesinde yetişir. Yapısında beta-karoten, kalsiyum, askorbik asit (C vitamini), allantion, apigenin, aucubin, baicalein, linoleicacid, oleanolicacid, sorbitol ve tannin içerdiği belirlenmiştir. Plantago lanceolata ve diğer bazı türler geleneksel medikal alanda birçok amaç için kullanılmaktadır. Sinirli ot genellikle solunum organları hastalıklarında kullanılmaktadır. Sinirli ot tohumlarının yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterolü (HDL-Faydalı kolesterol) düzeyini etkilemeden toplam kolesterol düzeyini düşürebildiği ayrıca Plantago lanceolata (Dar yapraklı sinirli ot) eksraktının S.aures ve B.subtilis üzerine antibakteriyel aktivitesi olduğu bildirilmiştir.

Equisetum arvense (At kuyruğu otu, Kırkkilit otu) Avrupa, Asya ve Amerika tropik ve subtropik bölgelerinde yabani olarak yetişir. Tarihte ilk defa Çinlilerin ilaç kodeksinde (1057) adı geçen bitki Avrupa’da 16. yy.dan itibaren kullanılmaya başlanmıştır. Yapısında flavonoidlerden Equisetin, Quercetin, Luteolin, Apigenin içerdiği bildirilmiştir. İdrar artırıcı, kan kesici ve vereme karşı kullanılmıştır. Bademcik iltihabı, ağız boşluğu ve dişeti kanamalarında ve iltihaplarında, gargara biçiminde kullanıldığı bildirilmiştir.

 Equisetum arvense ekstraktlarının S.aureus, P.aeruginosa ve B.cereus’a karşı antimikrobiyal aktivite gösterdiğini fakat E.coli,
C. pseudotropicalis ve S. cerevisiae ’ye karşı aktivite göstermediğini bildirilmiştir.

Curcuma longa (Zerdeçal), Equisetum arvense (Kırkkilit otu), Olea europaea (Zeytin) Yaprağı ve Plantago lanceolota (Damar otu) bitkileri geleneksel tedavi ve gıda alanında kullanılan önemli bitkilerdir. Bu çalışmada Türkiye’de yetişen Curcuma  longa, Equisetum arvense, Olea europaea Yaprağı, Plantago lanceolota ve Hindistan’dan ithal edilen Curcuma longa bitkilerinden etanol ekstraksiyon yöntemiyle elde edilen ve ticari olarak satılan bitki ekstraktlarının hastane enfeksiyonlarında da rol alan bazı bakteriler üzerine antimikrobiyal aktivitelerini araştırmak amaçlandı.

YÖNTEM

Çalışmada, Curcuma longa, Equisetum arvense, Olea europaea Yaprağı, ve Plantago lanceolota bitkilerinden etanol ekstraksiyon yöntemiyle elde edilmiş ticari bitki ekstraktları kullanıldı. Etken madde içeriği 185mg/ml olacak şekilde sulandırılmış sıvı haldeki bitki ekstraktlarından 0,1 ml alınıp Nutrient Agar’a ekildi ve 24 saat 37 oC ‘de inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonunda tüm bitki ekstrelerinin steril olduğu belirlendi. Steril bitki özlerinin, hastane kökenli enfeksiyonların önemli etkenlerinden olan Escherichia coli (ATCC 259222), Genişleşmiş Spektrumlu Beta Laktamaz (ESBL) Escherichia coli (ATCC 35218) ve Klebsiella pneumoniae (ATCC 700603), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Enterococcus faecalis (ATCC 291212), Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Metisilin Dirençli S.aureus (MRSA) (Klinik izolat)  üzerine antibakteriyel aktiviteleri Klinik ve Laboratuvar Standartları Kurumu (Clinical and Laboratory Standards Institute-CLSI-M07-A9) disk diffüzyon yöntemiyle araştırıldı. Bu yöntemde test edilecek mikroorganizmalar % 0,9’luk fizyolojik tuzlu su içerisinde McFarland 0.5 (10 8 mikroorganizma/ml)’e göre ayarlanarak standart bir bulanıkta süspansiyon oluşturuldu. Bu süspansiyondan steril bir eküvyon yardımıyla alınan örnek Mueller-Hinton Agar yüzeyine inoküle edildi. Takiben ticari bitki özlerinden 25µl emdirilmiş ve 30oC’de kurutulmuş diskler steril pens yardımıyla agar yüzeyine yerleştirildi. Araştırmada Gentamisin diskleri pozitif kontrol olarak kullanıldı. Besiyerleri 18-24 saat süreyle 35oC’de inkübe edildi ve süre sonunda 7 mm’den daha büyük olan inhibisyon zonları kaydedildi.

BULGULAR

Araştırmada, disk diffüzyon yöntemi ile 4 bitki ekstaktının hastane kökenli enfeksiyonlara neden olan 6 bakteriye karşı üreme inhibisyon zon değerleri tablo 2 de verilmiştir. Olea europaea yaprağı ve Plantago lanceolota ekstraktlarının P. aeruginosa, MRSA ve S.aureus’a karşı, Equisetum arvense ekstraktının MRSA ve S.aureus’a karşı, Curcuma longa ekstraktının P. aeruginosa ve S.aureus’a karşı antibakteriyel aktivitesinin olduğu belirlendi.

İnhibisyon zonunun büyüklüğüne göre en yüksek antibakteriyel aktivite Olea europaea yaprağı ekstraktından elde edilirken, en düşük antibakteriyel aktivite Curcuma longa ekstraktından elde edildi. Tüm bitki ekstraktlarına karşı en duyarlı bakterinin S.aureus olduğu belirlenirken, E.coli, GSBL E.coli ve K.penuomiaea tüm bitki ekstraktlarına karşı direnç gösterdi.

Tablo 2. Bitki ekstraktlarının antibakteriyal aktivitesi  

Ticari Bitki EkstraktıAntibakteriyal aktivite inhibisyon zonu (mm)
* E.coliE.coliP.aureginosa*K.pneumonia**S.aureusS.aureusE.feacalis
Olea europaea yaprağıRR16R3634R
Plantago lanceolotaRR9R2523R
Equisetum arvenseRRRR1213R
Curcuma longaRRRR89R
Gentamisin1417 191123 21 17
* Genişlemiş Spektrumlu β-Laktamaz,  R: Dirençli, ** Metisilin Dirençli

 

 

Şekil 2. Disk Diffüzyon Testinde inhibisyon zon alanı

sekil

TARTIŞMA VE SONUÇ

Bu araştırmada, 4 adet ticari bitki ekstraktının hastane kökenli enfeksiyonlara neden olan bazı patojen bakterilere karşı değişen derecelerde in vitro antibakteriyel aktivite gösterdiği belirlendi. İncelenen bitki ekstraktları içinde en geniş spektrumlu Olea europaea yaprağı ve Plantago lanceolota ekstraktları oldu. Her iki bitki ekstraktı da MRSA ve S.aureus’a karşı poztif kontrol olarak kullanılan Gentamisin (10µg)’den daha büyük bir zon oluşturdu. Ayrıca en yüksek antibakteriyel aktivite Olea europaea yaprağı ekstraktında gözlendi. Elde edilen sonuçlar, etanol ekstraksiyon yöntemiyle elde edilen ticari bitki ekstraktlarının in vitro antibakteriyel özellikte olduğunu gösterdi. Yapılan araştırmalarda, zeytin yaprağı ekstresi için oleuropein, zerdeçal için curcumin en dikkat çekici antibakteriyel etkiden sorumlu olabilecek kimyasal maddeler olduğu bildirilmiştir.

Bu bitkilerin antibakteriyel aktiviteleri ile ilgili yapılan çeşitli çalışmalarda benzer sonuçlar belirlense de, farklı sonuçlara da rastlanmıştır. Bu farklılıkların bitki içeriğindeki kimyasal maddeler ve kullanılan bakteri türleriyle ilişkili olabilir. Bir bitkide bulunan kimyasal maddelerin, coğrafi özellik, gelişim dönemi ve ekstraksiyon işlemine bağlı olarak değişebileceği rapor edilmiştir.

Sonuç olarak, başta Olea europaea yaprağı ekstraktı olmak üzere, antibakteriyel aktivitesi belirlenen bitki ekstraktlarının medikal ve gıda endüstrisi gibi birçok alanda bakterilere karşı etkili olabileceği düşünülmüştür.

TEŞEKKÜRLER

İmmu-Nat Bitkisel İlaç ve Doğal Sağlık Ürünleri firmasına destekleri için teşekkürler.

KAYNAKLAR

1-Benavente-Garcia, O., Castillo, J., Lorente, J., Ortuno, A., Del Rio, J.A., (2000). Antioxidant activity of phenolics extracted from Olea europaea L. leaves. Food Chem. 68, 457–462.
2-Bianco, A., Uccella, N., (2000). Biophenolic components of olives. Food Res. Int. 33,475–485.
3-CLSI- Clinical and Laboratory Standards Institute, (2012). Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically. Approved Standard—Ninth Ed. CLSI document M07-A9. Wayne, Pennsylvania.
4-De, R., Kundu, P., Swarnakar, S., Ramamurthy, T., Chowdhury, A., Nair, G.B., Mukhopadhyay, A.K., (2009). Antimicrobial activity of curcumin against Helicobacter pylori isolates from India and during infections in mice. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 53, 1592–1597.
5-Gucci, R., Lombardini, L., Tattini, M., (1997). Analysis of leaf water relations in leaves of two olive (Olea europaea) cultivars differing in tolerance to salinity. Tree Physiol. 17, 13–21.
6-Jagetia, G.C., Aggarwal, B.B., (2007). “Spicing up” of the immune system by curcumin. Journal of Clinical Immunology 27, 19–35.
7-Japón-Luján R, Luque-Rodríguez J, Luque de Castro M., (2006).Dynamic ultrasoundassisted extraction of oleuropein and related biophenols from olive leaves. J Chromatogr A;1108:76–82.
8-Jasna M. Ve ark., (2006). Radical scavenging and antimicrobial activity of horsetail (Equisetum arvense L.) extracts. International Journal of Food Science and Technology 2009, 44, 269–278.
9-Kahyaoğlu M, Türkoğlu İ., (2008).Antimicrobial activies of some plants collected in Elazığ region. Dumlupınar Univ Fen Bil Derg, 15, 1-8.
10-Korukluoglu M.,  Sahan Y., Yiğit A., Özer E.T. ve Gücer Ş.,(2010). Antibacterial Activity and Chemical Constitutions of Olea europaea  L. Leaf  Extracts. Journal of Food Processing and Preservation 34: 383–396.
11-Metiner K. Özkan  O. Ak S.,(2012). Antibacterial Effects of Ethanol and Acetone Extract of Plantago major L. on Gram Positive and Gram Negative Bacteria. Kafkas Univ Vet Fak.Derg18 (3): 503-505.
12-Mun S.H., Joung D.K., Kim Y.S., Kang O.H., Kim S.B., Seo Y.S., Kim Y.C., Lee D.S., Shin D.W., Kweon K.T., Kwon D.Y., (2013). Synergistic antibacterial effect of curcumin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytomedicine 20: 714– 718.
13-Nostro A., Germano M.P. Á , D’Angelo V., Marino A., Cannatelli M.A., (2000). Extraction methods and bioautography for evaluation of medicinal plant antimicrobial activity. Letters in Applied Microbiology 30, 379-384.
14-Nostro A., Germano M.P., D’Angelo V., Marino A.and Cannatelli M.A., (2000). Letters in Applied Microbiology, 30, 37-384
15-Na H.S., Cha M.H., Oh D.R., Cho C.W., Rhee J.H., and Kim Y.R., (2011).Protective mechanism of curcumin against Vibrio vulnificus infection, FEMS Immunology & Medical Microbiology, vol. 63, pp. 355–362.
16-OGM (Orman Genel Müdürlüğü) Atkuyruğu otu, Erişim tarihi 10.03.2014. Erişim adresi :http://web.ogm.gov.tr/birimler/merkez/odundisiurun/Dkmanlar/bitkisel_urunler_sube_mudurlugu/bıtkısel urunler/atkuyruğu.pdf
17-Rudrappa, T., Bais, H.P., (2008). Curcumin, a known phenolic from Curcuma longa, attenuates the virulence of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in whole plant and animal pathogenicity models. Journal of Agricultural and Food Chemistry 56, 1955–1962.
18-Shishodia, S., Sethi, G., Aggarwal, B.B., 2005. Curcumin: getting back to the roots. Annals of the New York Academy of Science 1056, 206–217.
19-Sudjana AN, D’Orazio C, Ryan V, Rasool N, Ng J, Islam N, Riley TV, Hammer KA., (2009). Antimicrobial activity of commercial Olea europaea (olive) leaf extract. International Journal of Antimicrobial Agents 33 461–463.
20-Tasioula-Margari,M., Ologeri, O., (2001). Isolation and characterization of virgin olive oil phenolic compounds by HPLC/UV and GC/MS. J. Food Sci. 66, 530–534.